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基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒的檢測步驟介紹
釋出時間·◕₪•:2022-08-27   點選次數·◕₪•:75次
  基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒的檢測步驟·◕₪•:
 
  1☁↟╃₪◕、製備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠·◕₪•:推薦分離膠濃度為8%╃•。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrateG並使之稀釋10倍☁☁,混勻後加入過硫酸銨和TEMED☁☁,等待凝膠聚合╃•。
 
  2☁↟╃₪◕、待測樣品·◕₪•:切勿加熱變性☁☁,並且僅使用不加還原劑的上樣緩衝液╃•。可透過預試驗確定加樣量☁☁,使用普通蛋白預染Marker即可╃•。
 
  3☁↟╃₪◕、低電流恆流電泳☁☁,每一塊小膠電流為20mA/gel╃•。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳╃•。
 
  4☁↟╃₪◕、洗滌凝膠·◕₪•:取出凝膠☁☁,去除濃縮膠☁☁,放入容器內.可先用適量蒸餾水沖洗凝膠☁☁,然後加入10ml1×BufferA(用蒸餾水稀釋)☁☁,室溫漂洗凝膠2×30分鐘╃•。中間換液╃•。
 
  5☁↟╃₪◕、孵育·◕₪•:加入10ml1×BufferB(蒸餾水稀釋)☁☁,室溫或37ºC孵育1~5小時╃•。陽性對照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小時即可顯示╃•。如MMP活性低☁☁,應延長孵育時間為10小時或過一夜╃•。
 
  6☁↟╃₪◕、顯色·◕₪•:倒掉BufferB☁☁,加入凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液╃•。凝膠的大部分割槽域被深染☁☁,在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區域╃•。透明區域的位置和範圍指示MMP-2☁↟╃₪◕、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性╃•。
 
  7☁↟╃₪◕、條帶掃描·◕₪•:將凝膠放在掃描器上掃描╃•。雖然MMP條帶透明☁☁,但凝膠背景並非真正全黑╃•。解決辦法·◕₪•:可用非透射光掃描☁☁,或用軟體影象處理程式調整背景顯示為灰度顯示☁☁,並儘量設定為黑色.MMP條帶則為白色╃•。
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