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基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒

基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒

簡要描述₪╃:

上海信帆生物代理銷售基質金屬蛋白酶(mmp-2/9)明膠酶譜試劑盒··,現貨供應,歡迎╃✘✘↟。基質金屬蛋白酶(mmp-2/9)試劑盒操作簡單··,*··,靈敏度高歡迎╃✘✘↟。本試劑盒採用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2╃☁│·、MMP-9 活性╃✘✘↟。試劑盒規格750T!

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基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒描述₪╃:基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌··,活化後能夠降解 細胞外基質的膠原蛋白··,又稱膠原酶╃✘✘↟。透過影響細胞外基質··,膠原酶參與胚胎髮育╃☁│·、形態發生╃☁│·、組 織重··,╃☁│·、╃☁│·、╃☁│·、多疾╃✘✘↟。血漿與組 MMP-2╃☁│·、MMP-9 參與各種生理與病理過程··,其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視╃✘✘↟。

本試劑盒採用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2╃☁│·、MMP-9  活性╃✘✘↟。Zymography  是一種廣為使用的╃☁│·、基 SDS-PAGE 相凝蛋白酶··,其靈敏 1 nM··, ELISA 2··, 本原理和程式是₪╃:製備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠··,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電 泳··, 電泳結束後取出凝膠與酶反應 Buffer 孵育··,凝膠染色與脫色╃✘✘↟。凝膠中由於含底物蛋白而被深 ··, 色背··,在有蛋帶的··,酶將降膠中的··, 而形 ··,同時指 MMP-2╃☁│·、MMP-9 小位()╃✘✘↟。劑盒MMP-2╃☁│·、MMP-9 蛋白物及學反緩衝··,可測少 0.1~0.5 µl MMP-2╃☁│·、MMP- 9 酶譜及活性··,檢 測靈敏度~1 nM╃✘✘↟。試劑盒可進行 50 次標準小膠檢測··,如果小膠加樣孔為 10~15個··,則總計可檢測 500~750 個樣品╃✘✘↟。

基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒適用: 檢測 MMP-2╃☁│·、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)╃✘✘↟。

組成與儲存 (50 assays)₪╃:

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 ºC;
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 ºC;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋;

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋;

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液, 4 ºC╃✘✘↟。

檢測步驟₪╃:

1. 製備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠₪╃:推薦分離膠濃度為 8%╃✘✘↟。按照標準程式製備 SDS- PAGE 凝膠╃✘✘↟。將 10 × substrate G 融化··,並 90 ºC 加熱 5 分鐘╃✘✘↟。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 並使之稀釋 10 倍··,混勻後加入過硫酸銨和 TEMED··,等待凝膠聚合╃✘✘↟。

2. 待測樣品 1:1 稀釋於 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完後可自行配製₪╃:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)··,混合後直接上樣╃✘✘↟。切勿加熱變性··,並且僅 使用不加還原劑的上樣緩衝液╃✘✘↟。可透過預試驗確定加樣量··,使用普通蛋白預染  Marker 即可╃✘✘↟。陽 性對照(可選步驟)₪╃:可取人╃☁│·、小鼠╃☁│·、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體積混合··,取 5-15µl 上樣╃✘✘↟。

3. 低電流恆流電泳··,每一塊小膠電流為 20mA/gel╃✘✘↟。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳╃✘✘↟。

4. 洗滌凝膠₪╃:取出凝膠··,去除濃縮膠··,放入容器內.可先用適量蒸餾水沖洗凝膠··,然後加入10ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)··,室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘╃✘✘↟。中間換液╃✘✘↟。

5.  孵育₪╃:倒掉 Buffer A╃✘✘↟。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)··,室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時╃✘✘↟。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時即可顯示╃✘✘↟。如 MMP 活性低··,應延長孵育時間為 10 小時或 過一夜╃✘✘↟。

6.  顯色₪╃:倒掉 Buffer B··,加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書)╃✘✘↟。凝膠的大部分割槽域被深染··,在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區域╃✘✘↟。透明區域的位置和範圍指示 MMP-2╃☁│·、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性╃✘✘↟。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)╃☁│·、92 (MMP-9)╃☁│·、130 (proMMP-9)╃☁│·、225 (proMMP-9) kDa 位置出現透明條帶╃✘✘↟。

7. 條帶掃描₪╃:將凝膠放在掃描器上掃描╃✘✘↟。雖然 MMP 條帶透明··,但凝膠背景並非真正全黑╃✘✘↟。解決 辦法₪╃:可用非透射光掃描··,或用軟體影象處理程式調整背景顯示為灰度顯示··,並儘量設定為黑色.MMP條帶則為白色··,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式╃✘✘↟。

 

1. 10 mM 能夠 EDTA 完全抑制 MMP 活性╃✘✘↟。

2. 凝膠乾燥₪╃:可使用聚丙烯醯胺凝膠幹膠裝置室溫快速乾燥凝膠··,作為*記錄保留╃✘✘↟。

參考文₪╃:

  1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

  2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem··,1980, 102, 196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書(試劑盒自帶)

常規考馬斯亮藍 SDS-PAGE 凝膠蛋白質染色是實驗室常用的凝膠染色方法╃✘✘↟。銀染方法雖然靈敏度 高··,但所需試劑複雜並且有毒有害··,操作步驟繁瑣··,難以控制獲得好的染色效果╃✘✘↟。

染色步驟₪╃:

1. 此染色液即為工作液··,使用時直接將聚丙烯醯胺凝膠放在培養皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠··,並緩慢搖動 2h;

2. 傾去染色液··,用脫色液沖洗凝膠;

3. 以脫色液覆蓋凝膠··,緩慢搖動 2h··,傾去脫色液··,再加入新脫色液進行脫色··,直至獲得清晰的 藍色的條帶和乾淨的背景(通常此過程需要 2~4h··,也可脫色過一夜至清晰的藍色的條帶和乾淨 的背景);

4. 對凝膠進行分析和照相··,凝膠可放置在    7%的乙酸中儲存╃✘✘↟。也可用凝膠幹膠裝置對 凝膠進行處理後儲存╃✘✘↟。

安全性₪╃:含有甲醇··,無特殊毒性··,按一般化學品操作規程處理╃✘✘↟。

說明₪╃:

1. 染色液配方₪╃:0.25g 考馬斯亮藍 R250 420ml 甲醇 100ml 冰乙酸··,定容至 1000ml··,混合 1h 後用 Whatman 1 號濾紙過濾··,於室溫可無限期儲存;

2. 脫色液配方₪╃:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V);

3. 儲存液₪╃:7%冰醋酸;

4. 凝膠染色之後··,染色液可以回收利用··,裝入新容器內··,室溫或 4 ºC 儲存··,可反覆使用 2-4 次╃✘✘↟。

 

 

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